幹貨 | 常見(jiàn)病毒滅活/去(qù)除工(gōng)藝盤點及解讀(dú)

幹熱(rè)處理(lǐ)是在制品凍幹後進行的熱(rè)處理(lǐ)。該技術(shù)處理(lǐ)溫度爲60~100℃，持續時間爲30min~4d，需要加入穩定劑，防止蛋白(bái)過度變性。一般，溫度越高，病毒滅活時間越短(duǎn)。影(yǐng)響幹熱(rè)法病毒滅活效果的因素有很多，如(rú)制品中組分(fēn)/蛋白(bái)質濃度/凍幹穩定劑成分(fēn)和濃度的差異，制品最終容器的大(dà)小/分(fēn)裝量/凍幹曲線和封口形式的差異等，因此，實際生(shēng)産過程需要嚴格操作(zuò)。

巴氏消毒法是指在60±0.5℃的環境下，将蛋白(bái)質溶液進行連續加熱(rè)處理(lǐ)（≥10小時），從(cóng)而破壞病毒蛋白(bái)質及核酸分(fēn)子結構，使其因變性而無法複制，從(cóng)而失去(qù)傳染性。該方法所采用的高溫條件(jiàn)會使制品中蛋白(bái)産品過度變性，因此需要加入穩定劑以保護蛋白(bái)聚合及功能活性。

S/D（solvent/detergent）法是指利用有機(jī)溶劑和非離(lí)子表面活性劑的組合分(fēn)解脂包膜病毒的類脂膜，破壞脂包膜病毒的類脂膜，類脂從(cóng)病毒表面脫落，使病毒失去(qù)粘附和感染細胞的能力來(lái)達到滅活病毒的效果。

有機(jī)溶劑常用磷酸三丁酯（TNBP）；非離(lí)子表面活性劑如(rú)Triton X-100或Tween80，有報道也用Triton X-45等。S/D處理(lǐ)可(kě)以滅活脂包膜病毒，對非脂包膜病毒無效。

使用S/D滅活，下遊必須有工(gōng)藝能夠把S/D試劑去(qù)除，另外S/D試劑對動物細胞有較強毒性，會影(yǐng)響指示病毒滴度測定檢測限，因此該工(gōng)藝的驗證需要盡可(kě)能提高加入指示病毒的初始滴度或提高病毒檢測方法的靈敏度。

低pH孵放(fàng)法是重組蛋白(bái)藥物純化工(gōng)藝中常用的關鍵步驟，其操作(zuò)過程簡單、病毒滅活效果好，其利用有脂包膜類病毒的囊膜和病毒衣殼蛋白(bái)在低pH條件(jiàn)下會逐漸變性而使病毒顆粒失去(qù)感染能力，從(cóng)而達到病毒滅活效果。

低pH孵放(fàng)不僅可(kě)以滅活有脂包膜類病毒，還(hái)可(kě)以沉澱HCP、DNA等雜質，對純化工(gōng)藝中的雜質去(qù)除也起到重要作(zuò)用。本方法對于無脂包膜類病毒則作(zuò)用微弱，但(dàn)在工(gōng)藝中的低pH（如(rú)pH4）處理(lǐ)（有時加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果還(hái)可(kě)能受pH值、孵放(fàng)時間和溫度、胃酶含量、蛋白(bái)質濃度、溶質含量等因素影(yǐng)響，滅活效果随着pH升高滅活效果降低，随着溫度升高滅活效果升高。

柱層析法（也稱色譜）根據蛋白(bái)質的理(lǐ)化性質的不同，進行蛋白(bái)分(fēn)離(lí)純化，從(cóng)而有效分(fēn)離(lí)雜蛋白(bái)及消除病毒等污染物。柱層析法包括親和層析、離(lí)子交換層析、疏水層析、反相(xiàng)層析等。使用親和層析去(qù)除病毒主要依靠病毒在親和填料中和其他(tā)非目标蛋白(bái)的雜質發酵液成分(fēn)一起流穿，并且不受填料壽命的影(yǐng)響。

離(lí)子交換層析去(qù)除病毒的能力主要是以靜(jìng)電作(zuò)用爲主導作(zuò)用，以陰離(lí)子層析（流穿模式）爲例，在緩沖液爲中性或弱堿性（如(rú)pH8.0）條件(jiàn)下，病毒帶負電荷，可(kě)以和填料帶正電荷的季铵陽離(lí)子結合，從(cóng)而結合到層析填料上，而目的蛋白(bái)則流穿，最終達到病毒去(qù)除的作(zuò)用。

病毒膜過濾是利用病毒和蛋白(bái)大(dà)小的不同，使小于平均孔徑的蛋白(bái)通過濾膜，将大(dà)于平均孔徑的病毒截留在膜内，從(cóng)而達到去(qù)除病毒的效果。

病毒去(qù)除膜過濾可(kě)以同時滿足病毒去(qù)除效果好、目的蛋白(bái)質通過性高(回收量、過濾時間)、目的蛋白(bái)質不變性的特點，另外不管是脂包膜病毒還(hái)是非脂包膜病毒,無論病毒基因組是 RNA還(hái)是DNA，基本靠孔徑大(dà)小來(lái)去(qù)除病毒，所以是當前最可(kě)靠的病毒去(qù)除技術(shù)。根據目的蛋白(bái)的大(dà)小，可(kě)以選擇平均孔徑不同的濾膜，其中平均孔徑爲20nm左右的産品被稱爲細小病毒濾膜。平均孔徑 35~ 50 nm的濾膜被稱爲逆轉錄酶病毒濾膜。

根據PDA Technical Report 41，高TMP（跨膜壓差）是病毒過濾的最劣條件(jiàn)之一。近年(nián)來(lái)的報告表明，過濾過程中的壓力釋放(fàng)以及之後的再加壓會影(yǐng)響病毒去(qù)除效果。

不同的病毒滅活/去(qù)除工(gōng)藝有着不同的優劣勢與應用領域，實際生(shēng)産中，應根據潛在污染病毒的特性，結合産品特性和生(shēng)産工(gōng)藝、病毒清除工(gōng)藝的作(zuò)用機(jī)制和清除能力的綜合評估，選擇适宜的病毒清除工(gōng)藝。

金華海孚生物技術有限公司，創建于2011年(nián)，是一家集生(shēng)物技術(shù)服務與研發爲一體(tǐ)的高新技術(shù)企業，專注于爲生(shēng)物藥品/制品的生(shēng)産企業及研發機(jī)構提供各類細胞（含重組細胞、幹細胞、免疫細胞等）及原輔料的質量檢測、病毒清除工(gōng)藝驗證技術(shù)服務。

左右滑動查看(kàn)更多，點擊看(kàn)大(dà)圖

毒種優質：背景清楚，純度高，滴度可(kě)達8~9Log10/ml。

服務可(kě)靠：可(kě)驗證客戶下遊工(gōng)藝對病毒的去(qù)除/滅活效果，爲客戶提供定制的病毒清除工(gōng)藝驗證服務。

高效無憂：保證客戶驗證工(gōng)藝無障礙開展且60天（常規IND申報項目）即可(kě)完成相(xiàng)關驗證，并提供權威的檢測報告。

符合法規：依據中國(guó)藥典2020年(nián)版、國(guó)藥監注、國(guó)家食品藥品監督管理(lǐ)局、ICH、USP等相(xiàng)關要求進行技術(shù)服務，包括《生(shēng)物制品病毒安全性控制》、《動物源性醫療器械病毒滅活/去(qù)除有效性驗證的原則》、Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or AnimalOrigin. 1999. ICH Q5A（R1）、Design, Evaluation, and Characterization of Viral Clearance Procedure.2016. USP General Chapter: <1050.1>等。