幹貨 | 支原體(tǐ)檢查的幾種方法比較

支原體(tǐ)能夠在特定的固體(tǐ)瓊脂培養基上形成經典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可(kě)以在固體(tǐ)培養基上培養支原體(tǐ)，通過觀察菌落形态以判斷是否存在支原體(tǐ)污染。這是最直觀的方法，也是最早的方法，但(dàn)人(rén)們後來(lái)發現有很多支原體(tǐ)難以在固體(tǐ)培養基上形成菌落，因此，該法容易造成假陰性結果。

支原體(tǐ)在液體(tǐ)培養基中也能夠較好地生(shēng)長，在支原體(tǐ)數目增長到一定程度之後，培養基中的PH值會發生(shēng)顯著變化，如(rú)果在培養基中添加指示劑，這種變化會非常直觀地顯現出來(lái)。

單純的液體(tǐ)培養基檢測經常受到指示劑加入量、變色範圍較小等因素的幹擾。因此液體(tǐ)培養法和固體(tǐ)培養法通常一起使用，使檢測結果更加可(kě)靠。培養法的檢測時間在28天左右，時間較長。

大(dà)多數支原體(tǐ)的DNA中AT堿基的含量較高（55%~80%），DNA熒光(guāng)染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可(kě)以結合到AT含量較高的DNA鏈上。所以在使用熒光(guāng)染料染色後，被支原體(tǐ)污染的指示細胞除了細胞核發出熒光(guāng)外，細胞表面、周圍培養基和培養皿中也含有熒光(guāng)小點。

爲防止檢測結果出現細胞破裂後散出DNA等不确定因素造成假陽性或不清晰的實驗結果，通常會使用待檢測樣品的培養液，去(qù)感染易使支原體(tǐ)增殖的指示細胞（無污染的Vero細胞或經藥品檢定機(jī)構認可(kě)的其他(tā)細胞），故又稱指示細胞法。

對于細胞粘附性比較差的支原體(tǐ)（精氨酸類支原體(tǐ)），染色法的檢出效果較差，所以在實際檢測過程中通常将染色法和培養法結合起來(lái)進行結果判定。

注：對可(kě)能引起指示細胞病變的且缺少有效中和抗體(tǐ)的高滴度病毒樣本來(lái)說(shuō)，不能使用DNA染色法進行檢測。

相(xiàng)較于其他(tā)PCR技術(shù)，實時熒光(guāng)定量PCR法可(kě)以通過觀察熒光(guāng)擴增曲線的擴增情況來(lái)實時檢測支原體(tǐ)的污染情況，具有較好的特異性和準确性。并且不需要在PCR擴增後再進行凝膠電泳，縮短(duǎn)了實驗時間，降低了交叉污染的風(fēng)險。

雖然支原體(tǐ)核酸擴增檢測法彌補了培養法和DNA染色法耗時長的缺點，也在一定程度上增加了檢測的靈敏度，但(dàn)因其陽性檢出率往往受到引物所能擴增的支原體(tǐ)種類的制約，且容易受到樣品核酸提取方法、與支原體(tǐ)親緣關系較近的基因幹擾等外源因素的影(yǐng)響。所以驗證每種支原體(tǐ)核酸檢測方法的檢測限(Detection Limit)、特異性(Specificity)、耐用性(Robustness)是非常必要的。