幹貨|淺析CAR-T細胞免疫治療

根據治療細胞的類型，我們大(dà)緻可(kě)以分(fēn)爲免疫細胞和幹細胞，如(rú)下圖所示。

CAR-T細胞治療是一種以患者自(zì)身(shēn)T細胞爲基礎的治療，通過白(bái)細胞分(fēn)離(lí)術(shù)收集患者的外周血單核細胞（PBMC細胞)，再分(fēn)離(lí)出特定的T細胞亞群，如(rú)CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細胞。分(fēn)離(lí)出的T細胞起始亞群需要持續和充分(fēn)的激活才能實現體(tǐ)外擴增，這就(jiù)需要通過T細胞受體(tǐ)信号和CD28、4-1BB或OX40信号等共刺激信号産生(shēng)主要的特異性信号，從(cóng)而激活T細胞。再通過電穿孔、慢(màn)病毒或逆轉錄病毒載體(tǐ)，将CAR基因導入激活的T細胞中進行基因修飾，從(cóng)而得(de)到可(kě)表達CAR基因的CAR-T細胞（如(rú)下圖所示爲整個CAR-T生(shēng)産的流程）。

曾有報道，作(zuò)爲兩家CAR-T原研藥生(shēng)産廠(chǎng)家，諾華的Kymriah和Kite制藥的Yescarta在早期CAR-T制備的失敗率都(dōu)比較高，而這些失敗的原因中除了病人(rén)因爲個體(tǐ)差異而導緻失敗外，制備得(de)到的CAR-T細胞質量和數量也是很重要的因素。

3.1 T細胞刺激後體(tǐ)積監控的重要性

由Springer（施普林格科(kē)學）公司于2017發行，題爲Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分(fēn)子生(shēng)物學方法 -急性髓細胞白(bái)血病-方法和方案）的參考标準方法流程中，刊登了一篇名爲Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章(zhāng)（如(rú)左下圖），由幾位著名的T細胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)編寫的急性髓細胞白(bái)血病自(zì)體(tǐ)Car-T細胞的生(shēng)成和擴增方法。

在3.1的＂從(cóng)AML患者擴增T細胞＂過程，由刺激日(rì)起計(jì)的第3天，每隔1天要進行細胞計(jì)數，保持細胞在1x10⁶細胞/mL。第6天磁珠轉移後，也需要進行細胞計(jì)數。

除了細胞計(jì)數外，還(hái)要通過庫爾特計(jì)數和粒度分(fēn)析儀Multisizer來(lái)記錄平均細胞體(tǐ)積（MCV），因MCV上升等于T細胞被激活，而在被激活後的第5-7天達到最大(dà)。然後随着T細胞開始休息而下降。當MCV變爲300 fL（通常在第9-14天範圍）時表明細胞得(de)到了充分(fēn)休息，可(kě)以進行後續的冷(lěng)藏或測試（如(rú)右下圖）。

通過監測T細胞的體(tǐ)積，比較不同CAR-T細胞及T細胞的平均體(tǐ)積差異，比較培養激活過程中的體(tǐ)積變化，幫助判斷細胞何時到靜(jìng)息/穩定狀态，另外幫助判斷細胞的激活強度，爲研究做出科(kē)學判斷或決定下一步操作(zuò)，如(rú)後期的功能檢測或冷(lěng)凍保存等。

那麽爲何庫爾特法的Multisizer可(kě)以準确地給出T細胞激活後體(tǐ)積的變化值呢(ne)？這是因爲庫爾特法的原理(lǐ)，以及Multisizer配備了數字脈沖處理(lǐ)器（DPP），庫爾特的原理(lǐ)是通過檢測單個細胞通過小孔時電壓的變化來(lái)精确記錄，并且換算得(de)到每個細胞的體(tǐ)積，而配備的數字脈沖處理(lǐ)器，可(kě)以使得(de)檢測的分(fēn)辨率達到nm級别，所以可(kě)以對細胞體(tǐ)積的微小變化都(dōu)能準确的記錄下來(lái)。

另外，如(rú)果采用傳統的顯微鏡或其他(tā)圖像法儀器觀察細胞體(tǐ)積的變化，不僅看(kàn)到的是二維的圖，并不能真正反映反映細胞整體(tǐ)真實的體(tǐ)積大(dà)小。并且細胞體(tǐ)積的微笑(xiào)變化，體(tǐ)積表征相(xiàng)對細胞直徑的表征更加明顯。譬如(rú)，10um的細胞，直徑變大(dà)了5%，由于圖像法的分(fēn)辨率差很難看(kàn)出差異，但(dàn)按體(tǐ)積計(jì)算，體(tǐ)積的增加能達到15.7%，加上Multisizer的DPP功能，可(kě)以實現所關注粒徑範圍最多400個粒徑分(fēn)析通道（如(rú)下圖所示），真正實現高分(fēn)辨地檢測體(tǐ)積的變化。

3.2 CAR-T細胞的數量和活率監控

2019年(nián)在SCI Immunotherapy雜志發表了一篇重磅文章(zhāng)《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，體(tǐ)外培養擴增過程中，除了使用Multisizer來(lái)檢測細胞體(tǐ)積外，細胞數量和活率的檢測也一樣重要。

不同處理(lǐ)得(de)到的CAR-T細胞擴增速率也是不同的，我們可(kě)以通過擴增時間的比較來(lái)檢查細胞生(shēng)長狀态的好壞，以此幫助分(fēn)析得(de)到合适的細胞培養條件(jiàn)和細胞處理(lǐ)方法。

另外，對于進入生(shēng)産化的細胞産品，所有的分(fēn)析儀器都(dōu)需要合規，包括來(lái)自(zì)FDA 21CFR Part11和GMP生(shēng)産要求，儀器操作(zuò)要有多級管理(lǐ)權限，操作(zuò)和報錯都(dōu)必須存有電子記錄，Vi-CELL BLU對已經考慮到了這些生(shēng)産質控的要求，所以分(fēn)析軟件(jiàn)都(dōu)能符合這些規定。

CAR-T細胞免疫治療的過程

CAR-T細胞免疫療法在近幾年(nián)來(lái)被越來(lái)越多大(dà)衆所了解，也有大(dà)量的生(shēng)物制藥公司加入到CAR-T細胞免疫治療的隊伍，國(guó)外目前上市原研藥還(hái)是諾華的Kymriah和被吉利德收購(gòu)德Kite制藥德Yescarta。而國(guó)内企業也在加緊研發和上市的步伐，其中複興凱特和藥明巨諾分(fēn)别在今年(nián)的2月和6月遞交了上市申請(qǐng)。如(rú)下是這幾家公司CAR-T研發生(shēng)産上市的進展表。其中，作(zuò)爲國(guó)内龍頭之一的南(nán)京傳奇也在全力地推動産品的商業化，預計(jì)下半年(nián)會在美國(guó)遞交上市申請(qǐng)。