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發布時間：2022-10-24 17:32 信息來(lái)源： 閱讀(dú)次數： 次
外源性DNA屬于生(shēng)物制品工(gōng)藝相(xiàng)關雜質，對其含量進行檢測可(kě)以确認産品純化工(gōng)藝是否合理(lǐ)，即能否有效去(qù)除外源DNA殘餘；同時可(kě)确認産品中雜質含量是否符合标準要求，該檢測值是生(shēng)物制品質量控制的重要參數之一。
外源性DNA的來(lái)源
生(shēng)産生(shēng)物制品的宿主細胞（細菌、真菌和哺乳動物細胞）基因組，如(rú)E.coli、釀酒酵母、Vero細胞等；
生(shēng)産用細胞攜帶的潛在病毒、包裝用病毒基因組或相(xiàng)關特定轉化序列，如(rú)逆轉錄病毒、輔助病毒、SV40大(dà)T抗原等；
質粒DNA，如(rú)包裝質粒或體(tǐ)外轉錄模闆。
外源性DNA殘留的風(fēng)險
感染性風(fēng)險：整合的或遊離(lí)的DNA病毒和反轉錄病毒的DNA在機(jī)體(tǐ)内外均具有感染性，感染後可(kě)産生(shēng)感染性病毒粒子，其風(fēng)險可(kě)能比緻癌性風(fēng)險更高。
緻癌性風(fēng)險：現存的主要緻癌機(jī)制是引入的顯性緻癌基因（如(rú)真核生(shēng)物中廣泛存在的ras基因），通過直接轉化使得(de)部分(fēn)正常細胞分(fēn)化爲瘤性細胞。
免疫原性風(fēng)險：細菌基因組富含的CpG組分(fēn)和未甲基化修飾的序列會刺激非特異性免疫反應，增加免疫原性風(fēng)險。
緻突變性風(fēng)險：哺乳動物細胞基因組中含有高拷貝數的轉座子，可(kě)通過異位重排改變基因組從(cóng)而緻突變。
外源性DNA殘留的限定标準
《中國(guó)藥典》2020年(nián)版規定：細胞基質生(shēng)産的生(shēng)物制品DNA殘留量不高于100 pg/劑、細菌或真菌基質生(shēng)産的制劑DNA殘留量不超過10 ng/劑；
美國(guó)藥典：規定成品中殘留DNA不高于10 ng/劑、長度不大(dà)于200 bp；
歐洲藥典：規定殘留DNA不超過10 ng/劑，具體(tǐ)可(kě)接受限度需由權威機(jī)構批準。
後台回複“外源性DNA殘留”，獲取相(xiàng)關法規原件(jiàn)。
外源性DNA殘留的檢測方法
DNA 探針雜交法
根據檢測目标DNA設計(jì)特異性探針，同位素或熒光(guāng)染料标記後與固定在膜上的變性DNA樣本雜交并顯現斑點，通過與DNA标準品信号值對比來(lái)估算樣本中DNA殘留量。
該方法優勢在于可(kě)通過電泳估計(jì)DNA分(fēn)子大(dà)小，但(dàn)缺點也很明顯，即實驗耗時長（48 h）。另外，若用同位素标記探針，靈敏度能達到pg級，但(dàn)隻能半定量檢測且有放(fàng)射性污染風(fēng)險；熒光(guāng)染料标記探針能對DNA殘留進行定量檢測，但(dàn)靈敏度有所降低。
熒光(guāng)染色法
應用熒光(guāng)染料picogreen與雙鏈DNA結合形成複合物，在480 nm激發光(guāng)、520 nm接收光(guāng)下檢測，在一定的DNA濃度範圍及熒光(guāng)染料過量的條件(jiàn)下熒光(guāng)強度與DNA濃度成正比，根據熒光(guāng)強度計(jì)算樣本中DNA殘留量。
該方法操作(zuò)簡單、成本低廉、無需純化DNA；純DNA條件(jiàn)下靈敏度爲0.2 ng/ml，基質中單鏈DNA和RNA對檢測影(yǐng)響較小，高濃度蛋白(bái)對檢測有幹擾，故疫苗類産品經方法學驗證後是可(kě)以使用的，但(dàn)不适用于高劑量的蛋白(bái)類制品；該方法對各類DNA具有通用性，無需對不同類型DNA設計(jì)特異性探針，但(dàn)也因其特異性差易受環境中DNA污染。
定量PCR法
對外源性DNA設計(jì)特異性引物和熒光(guāng)标記的探針，以反應體(tǐ)系中熒光(guāng)數值反映特異性擴增産物量，當反應過程中熒光(guāng)強度達到預設的阈值時，體(tǐ)系的PCR循環數與該體(tǐ)系所含有的起始DNA模闆量的對數呈線性關系，依據DNA标準品測定樣本中外源性DNA殘留量。
該方法序列特異性強、靈敏度高（fg級）、重現性好，是中國(guó)藥典、美國(guó)藥典和歐洲藥典均推薦的方法；靶标區域的選擇、引物和探針的特異性、DNA标準品質量對方法的靈敏度和準确度有較大(dà)影(yǐng)響，需針對不同外源性DNA開發特異的檢測體(tǐ)系和DNA标準品。
免疫阈值法
應用單鏈DNA結合蛋白(bái)捕獲變性的單鏈DNA，然後用尿素酶标記的抗-DNA抗體(tǐ)與結合的DNA反應，以尿素酶水解尿素後溶液pH變化反應體(tǐ)系中DNA含量，經DNA标準品計(jì)算殘留DNA含量。
該方法靈敏度高（1-3 pg），有标準化操作(zuò)流程，但(dàn)依賴單鏈DNA結合蛋白(bái)和抗-DNA單克隆抗體(tǐ)兩種蛋白(bái)與DNA的結合，費用較高且需片段不小于600 bp。
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參考文獻：
Xing Wang,Donna M. Morgan,Gan Wang, Ned M. Mozier1.Residual DNA Analysis in Biologics Development: Review of Measurement and Quantitation Technologies and Future Directions.Biotecnology
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金華海孚生物技術有限公司，創建于2011年(nián)，是一家集生(shēng)物技術(shù)服務與研發爲一體(tǐ)的高新技術(shù)企業，專注于爲生(shēng)物藥品/制品的生(shēng)産企業及研發機(jī)構提供各類細胞（含重組細胞、幹細胞、免疫細胞等）及原輔料的質量檢測、病毒清除工(gōng)藝驗證技術(shù)服務。
