幹貨 | 細胞鑒定——成瘤性檢查方法及法規解讀(dú)

1. 新建細胞系/株以及新型細胞基質。

2. 某些傳代細胞已證明在一定代次内不具有成瘤性，而超過一定代次則具有成瘤性（如(rú)Vero）。

3. 用于疫苗生(shēng)産的細胞系/株應進行成瘤性檢查，但(dàn)當未經遺傳修飾的二倍體(tǐ)細胞被證明無成瘤性後，可(kě)以不作(zuò)爲常規檢查要求。

注：已證明具有成瘤性的傳代細胞（如(rú)BHK21，CHO，C127等），或細胞類型屬成瘤性細胞（如(rú)雜交瘤細胞等），用于生(shēng)産治療性産品時可(kě)以不再做成瘤性檢查。

目前使用比較廣泛的成瘤性檢查方法有動物接種法（體(tǐ)内）和軟瓊脂克隆形成實驗（體(tǐ)外）。其中，體(tǐ)内法爲評價的标準，但(dàn)對某些細胞而言，體(tǐ)外法的結果也可(kě)以作(zuò)爲細胞成瘤性檢查的參考，尤其是低代次、在動物體(tǐ)内無成瘤性的傳代細胞系。

将待檢測細胞接種于皮下或者肌肉内注射。至少觀察16周接種部位是否有進行性結節形成，對出現的結節開始消退的動物，應在觀察期末處死。不能形成進行性結節的細胞，不視爲具有成瘤性。通常用 HeLa 或 HeLa S3細胞或其他(tā)已知成瘤性細胞作(zuò)陽性對照(zhào)，且對照(zhào)組至少設10隻動物，試驗才視爲有效。在觀察期末，處死所有動物，對注射部位及其他(tā)部位 (如(rú)心髒、肺、肝、脾、腎、腦及局部淋巴結)進行觀察和組織病理(lǐ)學檢查，判斷是否有接種細胞增生(shēng)，進一步判定接種細胞是否形成腫瘤或有轉移瘤。

使用低熔點瓊脂模拟細胞在體(tǐ)内的微環境培養細胞，通常使用其它已知具有成瘤性的細胞作(zuò)爲陽性對照(zhào)，對照(zhào)組與實驗組同步操作(zuò)。常規培養3周左右，培養過程中可(kě)視情況适當地補充細胞培養液，直到陽性組在顯微鏡下明顯觀察到大(dà)量細胞集落，培養終止。使用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下觀察并拍(pāi)照(zhào)記錄。

歐洲EMA、美國(guó)FDA以及WHO針對幹細胞、體(tǐ)細胞、成體(tǐ)幹細胞、轉基因細胞、基因治療産品以及生(shēng)産用動物細胞培養物等發布了多項指導原則。EMA在《人(rén)體(tǐ)細胞醫療産品的指導原則》中表示“如(rú)果可(kě)以預見(jiàn)細胞轉化風(fēng)險則應該展開成瘤性研究，重點檢測其增殖能力以及染色體(tǐ)完整性”，在《幹細胞醫療産品反思文件(jiàn)》中提到“多能幹細胞和體(tǐ)幹細胞都(dōu)存在腫瘤形成風(fēng)險，培養條件(jiàn)可(kě)能會嚴重影(yǐng)響幹細胞的基因組的不穩定，延長細胞培養有助于評估成瘤性和染色體(tǐ)穩定性”。

FDA指導原則認爲控制hESC衍生(shēng)的細胞産品中未分(fēn)化的ESC或其他(tā)細胞雜質水平是成瘤性風(fēng)險評價的主要方面，采用細胞增殖測定法和軟瓊脂集落形成法測定惡性轉化細胞，以檢測最終産品中的雜質細胞是否超過了最小腫瘤産生(shēng)劑量。FDA還(hái)重點討(tǎo)論了臨床前實驗物種的選擇和動物模型的預測能力，以評估植入細胞到達移植部位微環境中是否形成腫瘤，以及引起宿主細胞和植入細胞在各組織器官中發生(shēng)腫瘤轉化的風(fēng)險。