CAR-T生(shēng)産工(gōng)藝流程及優化考量（下）

4.  CART細胞結構

CAR結構包含

1. 抗體(tǐ)的單鏈可(kě)變區（scFv）
2. 非信号胞外區
3. 與scFv鏈接的鉸鏈區
4. 跨膜區
5. T細胞受體(tǐ)胞内CD3ζ區
6. 共刺激因子結構域

四代CAR的發展

• 第一代CART誘導T細胞激活僅通過cd3ζ信号域激活
• 第二代CART中增加了共刺激結構域
• 第三代CART增加兩個共刺激結構域
• 第四代CART增加酶、細胞因子和共刺激配體(tǐ)

5.  T細胞擴增

在CART細胞擴增過程中，細胞數量不斷增加，培養基體(tǐ)積增大(dà)，必須通過更多或更大(dà)的組織培養瓶，這極大(dà)地複雜化了制造過程，并且它無法實現大(dà)規模的生(shēng)産。

靜(jìng)态培養袋，允許較少的手動開放(fàng)處理(lǐ)，管道連接可(kě)以使其在無菌條件(jiàn)下進行。

另一種方法 使用生(shēng)物反應器，如(rú)Xuri細胞擴增系統和Wave生(shēng)物反應器系統，利用灌注機(jī)制添加營養物質以及去(qù)除生(shēng)長抑制物質，從(cóng)而簡化了制造過程。

6.  細胞因子刺激

細胞因子在工(gōng)藝中使用，作(zuò)爲刺激信号，對于CART細胞質量，表型等産生(shēng)重要影(yǐng)響。主要是γ鏈細胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同時使用/或者不适用IL-15.

諾華Yescarta使用IL-2，但(dàn)是IL-2會導緻分(fēn)化和耗竭的T細胞表型。IL-7/IL-15可(kě)以增強T細胞活化和增殖，二者聯合使用可(kě)以增加未分(fēn)化CART（TN，TSCM）的存活和維持。單獨添加IL-15也會增加耗竭表型，及抗凋亡活性。

和IL-2和IL-15比較，IL-21可(kě)以增加CD62L表達，增加抗腫瘤活性。

7.  抑制特定的信号通路(lù)

主要靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻斷T細胞分(fēn)化，産生(shēng)更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增加CD62L表達

• 體(tǐ)外AKT抑制劑也表現出增加T細胞抗腫瘤活性

• PI3K抑制劑idelalisib，降低調節性T細胞，逆轉腫瘤免疫耐受，增加低分(fēn)化CART細胞數量

8. 冷(lěng)凍保存

冷(lěng)凍保存CART細胞長達90天，不影(yǐng)響細胞的活力。使用前37℃過夜，可(kě)以恢複CART細胞活力。