珈創生(shēng)物 —— 生(shēng)物技術(shù)服務與研發爲一體(tǐ)的高新技術(shù)企業
優質高效透明
High quality, efficient and transparent
中國(guó)藥典要求對細胞系進行檢定，NMPA、FDA、EMA、世界衛生(shēng)組織（WHO） 和人(rén)類用藥注冊技術(shù)要求協調國(guó)際會議(yì)（ICH）的各種法規文件(jiàn)概述了對細胞庫檢定的要求和指導，以确認細胞的起源和曆史，并鑒定和測試細胞的身(shēn)份，穩定性和純度。
細胞檢定主要包括幾個方面：細胞鑒别、無菌檢查、支原體(tǐ)檢查、内外源病毒因子檢查、成瘤性/緻瘤性檢查等。
這些檢測項目對于 MCB 細胞和 WCB 細胞及生(shēng)産限定代次細胞均适用。
我們建議(yì)在藥物生(shēng)産的各個階段對哺乳動物和非哺乳動物細胞系進行檢定，包括：
主細胞庫（MCB） 工(gōng)作(zuò)細胞庫（WCB） 生(shēng)産終末細胞（EOPC） 病毒種子庫（VSS） 原材料及最終産品
細胞系檢測
細胞鑒别試驗
新建細胞系/株、細胞庫和生(shēng)産終末細胞應進行鑒别試驗，以确定爲本細胞，且無其他(tā)細胞的交叉污染。珈創生(shēng)物提供多種鑒别試驗，客戶可(kě)選擇一種或多種方法對其細胞系/株進行種屬鑒别。
染色體(tǐ)核型分(fēn)析
核型分(fēn)析的結果可(kě)以确認樣品的細胞系身(shēn)份和來(lái)源物種。我們擁有多種細胞（包括人(rén)源細胞，人(rén)源幹細胞，猴 Vero，倉鼠 CHO）核型細胞分(fēn)析的豐富經驗。
染色體(tǐ)核型分(fēn)析包括但(dàn)不限于：中期染色體(tǐ) G 顯帶分(fēn)析和染色體(tǐ)計(jì)數（提供二倍體(tǐ)染色體(tǐ)數，頻率分(fēn)布和多倍體(tǐ)水平）。
同工(gōng)酶試驗
對細胞乳酸脫氫酶（LD）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）和核苷磷酸化酶 （NP）三種酶分(fēn)别進行凝膠電泳試驗，并通過與指示細胞對比，确定有無交叉污染。
短(duǎn)串聯重複序列分(fēn)析(STR)
STR（短(duǎn)串聯重複序列）分(fēn)析法即通過提取樣品 DNA，PCR 擴增 STR 位點， PCR 産物檢測，檢測結果分(fēn)析，并與 ATCC 和 DSMZ 數據庫進行比對，以确定樣品種屬來(lái)源，判斷其是否存在其他(tā)人(rén)源細胞交叉污染。
無菌檢查
參考中國(guó)藥典通則 1101，提供符合法規要求的薄膜過濾法和直接接種法。無菌檢查均在 A 級隔離(lí)器或 C+A 級環境中進行，且在檢測過程中持續進行環境監測。
适用性檢查：均可(kě)按照(zhào)法規的要求，對不同的供試品進行适用性試驗。 以确認所采用的方法适合供試品的無菌檢查。
薄膜過濾法：采用封閉式薄膜過濾器，可(kě)過濾大(dà)量供試品以及利于解決供試品中可(kě)能存在微生(shēng)物生(shēng)長抑制劑等問(wèn)題。是可(kě)過濾供試品首選的檢測方法。
直接接種法：适用于無法用薄膜過濾法進行檢測的供試品，包括混懸液等非澄清水溶液、固體(tǐ)供試品、非水溶性供試品和滅菌醫療器械等。
分(fēn)枝杆菌檢查
珈創生(shēng)物參考中國(guó)藥典通則 1101，采用 Middlebrook 7H10 平闆培養法，提供符合法規要求的分(fēn)枝杆菌檢查。檢查均在A級隔離(lí)器或C+A級環境中進行，且在檢測過程中持續進行環境監測。
支原體(tǐ)檢查
珈創生(shēng)物參考中國(guó)藥典通則 3301，提供符合法規要求的支原體(tǐ)檢查包括培養法和指示細胞培養法（DNA 染色法）。
培養法：供試品分(fēn)别接種固體(tǐ)和液體(tǐ)培養基，于接種一周後取液體(tǐ)培養基轉種進行次代培養，觀察初代培養和次代培養結果。
指示細胞培養法（DNA 染色法）：供試品接種于對照(zhào)細胞，培養 3-5 天後傳代再培養 3-5 天，于培養期末進行染色觀察。
内外源病毒污染檢查
檢查細胞系/株中是否有來(lái)源物種中潛在的可(kě)傳染的病毒，以及由于使用的原 材料或操作(zuò)帶入的外源性病毒。細胞進行病毒檢查的種類及方法，須根據細胞種屬來(lái)源、組織來(lái)源、細胞特性、傳代曆史、培養方法及過程等确定。 在您開展檢測前，珈創願意與您進行充分(fēn)的溝通，确定合适的檢測方案。
細胞形态觀察及血吸附試驗
體(tǐ)外不同指示細胞接種培養法
動物體(tǐ)内接種法
乳鼠腦内及腹腔接種法
小鼠腦内及腹腔接種法
豚鼠腹腔接種法
家兔皮内及皮下接種法
雞胚接種法
雞胚卵黃(huáng)囊接種法
雞胚尿囊腔接種及尿囊液血凝試驗
逆轉錄病毒檢測
逆轉錄酶活性測定法 PERT
感染性試驗
透射電鏡觀察法
種屬特異性外源病毒因子檢測
應根據細胞系/株種屬來(lái)源、組織來(lái)源及供體(tǐ)健康狀況等确定檢測病毒的種類。
鼠源細胞系
鼠源病毒檢查
人(rén)源細胞系/株
人(rén)源病毒檢測Q-PCR法
牛源性病毒檢測
細胞培養法
熒光(guāng)抗體(tǐ)檢測法
豬源性病毒檢測
細胞培養法
普通PCR法
Q-PCR法
其他(tā)特定病毒檢測
鼠細小病毒檢測
細胞培養法
普通PCR法
Q-PCR法
杯狀病毒（Vesivirus 2117）檢測--Q- PCR法 CHO細胞系
成瘤性檢查
動物體(tǐ)内接種法（裸鼠）
軟瓊脂克隆形成試驗
幹細胞等不同類别細胞治療産品的生(shēng)産過程都(dōu)會涉及細胞的離(lí)體(tǐ)培養。而細胞離(lí)體(tǐ)培養必然會涉及生(shēng)物學屬性的變化、生(shēng)物學安全性改變、外源性污染、交叉污染等問(wèn)題，這些問(wèn)題嚴重影(yǐng)響研發初始到生(shēng)産過程的進展和成功。幹細胞産品的多樣性、複雜性對于其質量控制提出巨大(dà)的挑戰。
幹細胞的綜合質量要求可(kě)歸納爲基本生(shēng)物學屬性，微生(shēng)物學安全性，生(shēng)物學安全性及生(shēng)物學有效性四大(dà)類，珈創生(shēng)物期待與您進行充分(fēn)的溝通，确定合适的幹細胞質量控制方案。
基本生(shēng)物學屬性
細胞鑒别：
染色體(tǐ)核型分(fēn)析
同工(gōng)酶試驗
短(duǎn)串聯重複序列分(fēn)析(STR)
細胞活性鑒别：
細胞計(jì)數和細胞存活率檢測
細胞生(shēng)長曲線測定
細胞周期測定--PI 染色法
微生(shēng)物安全性評價
微生(shēng)物安全性方面，包括各類幹細胞在内的所有治療性細胞産品需具備生(shēng)産用細胞基質的微生(shēng)物安全性。需要對相(xiàng)關細胞進行無菌，支原體(tǐ)，分(fēn)枝杆菌，内外源特異或非特異性病毒，内毒素微生(shēng)物代謝産物的檢測。另外，在幹細胞的獲取，擴增，培養傳代和凍存過程中，應對所使用材料相(xiàng)關的可(kě)能的動物源性微生(shēng)物污染進行檢測。
生(shēng)物安全性評價
幹細胞的生(shēng)物學安全性主要由其細胞生(shēng)物學特性，細胞來(lái)源，制備工(gōng)藝等相(xiàng)關風(fēng)險因素決定，各種風(fēng)險因素可(kě)導緻細胞産品的異常免疫反應，緻瘤性和/或促瘤性等，目前幹細胞生(shēng)物安全性評價以免疫學反應和緻瘤性爲主要内容。
成瘤性檢查
端粒酶活性檢查
免疫學反應檢測
淋巴細胞增殖抑制試驗
特定淋巴細胞亞群檢測法（Th1,Th17,Treg）
淋巴細胞分(fēn)泌 TNF-α抑制試驗
生(shēng)物學有效性檢查
珈創生(shēng)物對于 MSC 的生(shēng)物學有效性可(kě)開展相(xiàng)應的檢測服務。
生(shēng)物學有效性評價
成骨細胞分(fēn)化試驗
成軟骨細胞分(fēn)化試驗
成脂細胞分(fēn)化試驗
珈創生(shēng)物在生(shēng)物制品的質量控制領域不停探索，爲您提供可(kě)靠的檢測服務，新的檢測服務持續開發中。
病毒種子批質量檢測服務
生(shēng)物制品生(shēng)産用菌毒種應采用種子批系統，應進行生(shēng)物學特性，生(shēng)化特性等檢測，珈創生(shēng)物結合中國(guó)藥典規定，爲客戶提供一定程度的病毒種子批和菌種檢測服務。
病毒種子批檢測服務
無菌檢查
支原體(tǐ)檢查
分(fēn)枝杆菌檢查
外源病毒因子檢查
病毒滴度測定
菌種檢測服務
原核或真核系統表達、生(shēng)産生(shēng)物制品，應對其重組菌（細菌、酵母菌）進行相(xiàng)應的鑒定和質量檢測，符合相(xiàng)關規定方可(kě)使用。
菌種檢測服務
菌株染色觀察
普通染色
革蘭氏染色
菌落形态觀察
菌株抗生(shēng)素抗性試驗
菌株生(shēng)化特征分(fēn)析--生(shēng)化反應試驗
菌種檢查--核酸序列測序分(fēn)析
噬菌體(tǐ)污染檢查
透射電鏡觀察--負染色法析
培養觀察--噬斑法
原材料檢測服務
對于不同風(fēng)險級别原材料的質量控制，應充分(fēn)考慮來(lái)源于動物（或人(rén)）的生(shēng)物原材料可(kě)能帶來(lái)的外源因子污染的安全風(fēng)險。
根據原材料的來(lái)源、生(shēng)産以及對生(shēng)物制品潛在的毒性和外源因子污染風(fēng)險等将生(shēng)物制品生(shēng)産用原材料按風(fēng)險等級别劃分(fēn)，對于不同風(fēng)險級别原材料，應充分(fēn)考慮可(kě)能帶來(lái)的外源因子污染的安全性風(fēng)險進行檢測。
珈創生(shēng)物能夠針對性的對生(shēng)産過程中所用的原料進行檢定，通過無菌，支原體(tǐ)，病毒外源因子，内毒素等檢測，來(lái)證明生(shēng)産過程的細胞培養成分(fēn)，添加物和胰酶等的質量。基因治療藥物生(shēng)産過程中的質粒 DNA 也可(kě)進行相(xiàng)應的檢定。
無菌檢查
支原體(tǐ)檢查
外源因子檢測
動物來(lái)源原材料牛源病毒測試
動物來(lái)源原材料豬源病毒測試
動物來(lái)源原材料鼠源病毒測試
内毒素檢測
無論是原核或真核系統表達、生(shēng)産生(shēng)物制品，都(dōu)存在不同程度的殘留物于産品中，因此，殘留物的檢測是必需的，否則嚴重影(yǐng)響産品質量。
如(rú)：牛血清白(bái)蛋白(bái)(Bovine serum albumin，BSA)是胎牛血清中的主要成分(fēn)，廣泛應用在抗體(tǐ)藥物、疫苗藥物以及CGT藥物等生(shēng)物制品的生(shēng)産過程中。對于疫苗類藥物，目前很多病毒性疫苗産品（如(rú)狂犬、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、水痘疫苗等）是采用細胞培養法生(shēng)産的，因此牛血清白(bái)蛋白(bái)(BSA)殘留量的檢測是疫苗産品中重要的質控指标，直接關系到疫苗使用的安全性。
如(rú)：抗生(shēng)素殘留對人(rén)體(tǐ)健康有着十分(fēn)嚴重的危害，包括“三緻”（緻癌、緻畸、緻突變）作(zuò)用、人(rén)體(tǐ)對此類藥物的長期暴露，通常不會造成急性中毒，而主要是引起慢(màn)性中毒。
抗生(shēng)素不是疫苗中的必須成分(fēn)，但(dàn)在一些疫苗的制備過程中，爲了防止細菌污染，所以要添加一些抗生(shēng)素。在最終成品前，還(hái)要盡量去(qù)除抗生(shēng)素。
《中國(guó)藥典 2020版 三部》中各種疫苗藥物的BSA的殘留量都(dōu)進行了明确規定：原液應不高于50ng/ml（除甲型肝炎滅活疫苗），成品應不高于50ng/劑。
我司參照(zhào)以上法規要求，搭建了相(xiàng)應的殘留物檢測技術(shù)體(tǐ)系，具體(tǐ)項目如(rú)以下表格：
表 1 原材料檢定項目彙總表
| 序号 |
類别(産品/項目/參數) |
産品/項目/參數 |
參考法規
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| 序号 | 名稱 | |||
| 1 |
殘留物檢測 |
1.1 |
牛血清白(bái)蛋白(bái)殘留檢測法 |
《中國(guó)藥典 2020版 三部》各論、通則3407 /3408/ 3411 |
| 1.2 |
抗生(shēng)素殘留檢測--培養法 （含青黴素、鏈黴素） |
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1.3 |
CHO細胞DNA殘留檢測法 |
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鏈接： 共同開發，聯系我們
在慢(màn)病毒載體(tǐ)的生(shēng)産過程中，因穿梭載體(tǐ)、包裝載體(tǐ)及包裝細胞中的内源性逆轉錄元件(jiàn)之間，或病毒載體(tǐ)與細胞的内源性逆轉錄元件(jiàn)之間發生(shēng)重組可(kě)能産生(shēng)具有複制能力的慢(màn)病毒，即複制型慢(màn)病毒（replication competent lentivirus, RCL）。鑒于RCL潛在的威脅，FDA及歐盟先後出台了相(xiàng)關文件(jiàn)，要求在在生(shēng)産及應用的不同階段進行RCR/RCL的控制，包括生(shēng)産病毒的細胞庫、終末細胞、病毒載體(tǐ)及轉導細胞，并對CAR-T細胞回輸後的患者個體(tǐ)進行監測。
敏感細胞共培養測定法
将可(kě)能存在RCL風(fēng)險的樣品在敏感細胞上擴增，并在指示終點利用敏感、快(kuài)速的檢測方法（ELISA p24蛋白(bái)測定法、Q-PCR法、産物增強性逆轉錄酶活性檢測法（PERT））進行檢測。
構建HIV-1弱毒株作(zuò)爲RCL實驗的陽性對照(zhào)病毒，設置陰性對照(zhào)、陽性對照(zhào)和抑制對照(zhào)，驗證反應體(tǐ)系的适用性，監測反應靈敏度。
RCL檢測方法已經過方法驗證，可(kě)滿足不同類型供試品的檢測需求。
主要法規依據
《CAR-T細胞治療産品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》，中國(guó)食品藥品檢定研究院，2018
《體(tǐ)外基因修飾系統藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）》，國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局藥品審評中心，2022
《免疫細胞治療産品藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）》，國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局藥品審評中心，2022
Guidance for Industry: Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up ，FDA，2020
Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) ，FDA，2020
EUROPEAN PHARMACOPOEIA 10.0
珈創生(shēng)物在生(shēng)物制品的質量控制領域不停探索，爲您提供可(kě)靠的檢測服務，新的檢測服務持續開發中。
