幹貨 | 外源性DNA殘留檢測簡介

外源性DNA屬于生(shēng)物制品工(gōng)藝相(xiàng)關雜質，對其含量進行檢測可(kě)以确認産品純化工(gōng)藝是否合理(lǐ)，即能否有效去(qù)除外源DNA殘餘；同時可(kě)确認産品中雜質含量是否符合标準要求，該檢測值是生(shēng)物制品質量控制的重要參數之一。

緻癌性風(fēng)險：現存的主要緻癌機(jī)制是引入的顯性緻癌基因（如(rú)真核生(shēng)物中廣泛存在的ras基因），通過直接轉化使得(de)部分(fēn)正常細胞分(fēn)化爲瘤性細胞。

免疫原性風(fēng)險：細菌基因組富含的CpG組分(fēn)和未甲基化修飾的序列會刺激非特異性免疫反應，增加免疫原性風(fēng)險。

緻突變性風(fēng)險：哺乳動物細胞基因組中含有高拷貝數的轉座子，可(kě)通過異位重排改變基因組從(cóng)而緻突變。

美國(guó)藥典：規定成品中殘留DNA不高于10 ng/劑、長度不大(dà)于200 bp；

歐洲藥典：規定殘留DNA不超過10 ng/劑，具體(tǐ)可(kě)接受限度需由權威機(jī)構批準。

熒光(guāng)染色法

應用熒光(guāng)染料picogreen與雙鏈DNA結合形成複合物，在480 nm激發光(guāng)、520 nm接收光(guāng)下檢測，在一定的DNA濃度範圍及熒光(guāng)染料過量的條件(jiàn)下熒光(guāng)強度與DNA濃度成正比，根據熒光(guāng)強度計(jì)算樣本中DNA殘留量。

該方法操作(zuò)簡單、成本低廉、無需純化DNA；純DNA條件(jiàn)下靈敏度爲0.2 ng/ml，基質中單鏈DNA和RNA對檢測影(yǐng)響較小，高濃度蛋白(bái)對檢測有幹擾，故疫苗類産品經方法學驗證後是可(kě)以使用的，但(dàn)不适用于高劑量的蛋白(bái)類制品；該方法對各類DNA具有通用性，無需對不同類型DNA設計(jì)特異性探針，但(dàn)也因其特異性差易受環境中DNA污染。

定量PCR法

對外源性DNA設計(jì)特異性引物和熒光(guāng)标記的探針，以反應體(tǐ)系中熒光(guāng)數值反映特異性擴增産物量，當反應過程中熒光(guāng)強度達到預設的阈值時，體(tǐ)系的PCR循環數與該體(tǐ)系所含有的起始DNA模闆量的對數呈線性關系，依據DNA标準品測定樣本中外源性DNA殘留量。

該方法序列特異性強、靈敏度高（fg級）、重現性好，是中國(guó)藥典、美國(guó)藥典和歐洲藥典均推薦的方法；靶标區域的選擇、引物和探針的特異性、DNA标準品質量對方法的靈敏度和準确度有較大(dà)影(yǐng)響，需針對不同外源性DNA開發特異的檢測體(tǐ)系和DNA标準品。

免疫阈值法

應用單鏈DNA結合蛋白(bái)捕獲變性的單鏈DNA，然後用尿素酶标記的抗-DNA抗體(tǐ)與結合的DNA反應，以尿素酶水解尿素後溶液pH變化反應體(tǐ)系中DNA含量，經DNA标準品計(jì)算殘留DNA含量。

該方法靈敏度高（1-3 pg），有标準化操作(zuò)流程，但(dàn)依賴單鏈DNA結合蛋白(bái)和抗-DNA單克隆抗體(tǐ)兩種蛋白(bái)與DNA的結合，費用較高且需片段不小于600 bp。