細胞治療産品安全性—RCL檢測

發布時間：2023-04-04 10:39 信息來(lái)源：閱讀(dú)次數：次

CAR-T細胞療法

免疫細胞療法廣泛應用于臨床，尤其是惡性腫瘤，是指采集人(rén)體(tǐ)自(zì)身(shēn)免疫細胞，經過體(tǐ)外改造、培養，使其數量擴增或增加其靶向殺傷能力，然後再回輸到患者體(tǐ)内，達到殺滅血液及組織中病原體(tǐ)、腫瘤細胞的目的。
CAR-T細胞治療技術(shù)因其安全性和廣泛适用性，成爲近年(nián)來(lái)一種發展較快(kuài)的抗腫瘤治療技術(shù)，但(dàn)實際應用中，以逆轉錄病毒或慢(màn)病毒爲載體(tǐ)的CAR-T細胞治療産品，也仍然存在一定安全隐患，其主要原因在于，作(zuò)爲載體(tǐ)的逆轉錄病毒或慢(màn)病毒仍有可(kě)能産生(shēng)具體(tǐ)有複制能力的病毒，即産生(shēng)複制性逆轉錄病毒（replication competent retroviruses，RCR）或産生(shēng)複制性慢(màn)病毒（replication competent lentivirus, RCL）。

潛在風(fēng)險

逆轉錄病毒載體(tǐ)和慢(màn)病毒載體(tǐ)均爲複制缺陷型載體(tǐ)，但(dàn)在病毒載體(tǐ)生(shēng)産過程中因穿梭載體(tǐ)、包裝載體(tǐ)及包裝細胞中的内源性逆轉錄元件(jiàn)之間，或病毒載體(tǐ)與免疫細胞的内源性逆轉錄元件(jiàn)之間發生(shēng)同源或非同源重組，會導緻可(kě)複制慢(màn)病毒(replication competent lentivirus，RCL)産生(shēng)。鑒于RCL潛在的威脅，FDA及歐盟先後出台了相(xiàng)關文件(jiàn)，要求在生(shēng)産及應用的不同階段進行RCL的控制，包括生(shēng)産病毒的細胞庫、終末細胞、病毒載體(tǐ)及轉導細胞，并對CAR-T細胞回輸後的患者個體(tǐ)進行監測。

現有技術(shù)中，RCL的檢測方法主要包括針對特定基因（如(rú)vsv-g基因、psi-gag基因）的pcr法或qpcr法快(kuài)檢技術(shù)以及敏感細胞感染試驗法等。爲了提高試驗的靈敏度，FDA推薦利用以細胞培養爲基礎的感染性試驗進行RCL的檢測，該方法首先将可(kě)能存在的RCL在敏感細胞上擴增，并在培養終點利用敏感、快(kuài)速的檢測方法進行檢測。在細胞擴增及指示階段需設置陰性對照(zhào)、陽性對照(zhào)以及抑制對照(zhào)組。陽性對照(zhào)一般爲減毒的HIV-1，抑制對照(zhào)是在供試品中加入一定量的減毒HIV-1，以排除實驗用量供試品可(kě)能會對C8166細胞的生(shēng)長或感染産生(shēng)抑制而出現RCL假陰性結果。經過培養的對照(zhào)組及供試樣品最終采用ELISA法測定p24含量、PCR／Q-PCR法測定psi-gag和VSV-G序列、測定逆轉錄酶活性（PERT法）等方法檢測RCL。

珈創生(shēng)物RCL檢測服務

珈創生(shēng)物構建了HIV-1弱毒質粒，包裝了HIV-1弱毒作(zuò)爲RCL實驗的陽性對照(zhào)病毒，并對陽性對照(zhào)與抑制對照(zhào)中HIV-1弱毒的添加量進行摸索，使用合适添加量，以驗證反應體(tǐ)系的适用性，又能監測反應靈敏度。同時，對供試品（慢(màn)病毒終末細胞、慢(màn)病毒上清液、CAR-T轉導細胞）添加量也進行實驗，以确保供試品不會明顯影(yǐng)響C8166敏感細胞的增殖和感染。供試品在C8166細胞中經過擴增階段和指示階段的培養後，感染終點的細胞上清将進行p24 Elisa檢測；同時細胞将用來(lái)提取DNA，進行psi-gag和VSV-G基因qPCR檢測（引物探針由本公司自(zì)行設計(jì)）。本公司建立的RCL檢測方法經過方法驗證，可(kě)滿足不同類型供試品的檢測需求。

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生(shēng)物制品病毒安全性相(xiàng)關法規

中國(guó)

（1）細胞治療産品研究與評價技術(shù)指導原則(試行) 2017

（2）CAR-T細胞治療産品質量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點 2018

（3）基因轉導與修飾系統藥學研究與評價技術(shù)指導原則 2020

（4）免疫細胞治療産品藥學研究與評價技術(shù)指導原則（征求意見(jiàn)稿）2020

（5）體(tǐ)外基因修飾系統藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）2022

美國(guó)

FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) Guidance for Industry［S］2020．

FDA. Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up Guidance for Industry［S］2020．

Briefing Document — Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products — Revisiting Current FDA Recommendations.

歐洲

EMA. Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing.

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參考文獻：

[1] 國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局藥品審評中心，體(tǐ)外基因修飾系統藥學研究與評價技術(shù)指導原則（試行）, 2022.

[2] FDA．Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up［EB/OL］(2018 )．

[3] EMA. Guideline on quality，non-clinical and clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products in clinical trials［EB/OL］．(2019)．

[4] Naldini L, Blömer U, Gallay P,etc. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7. PubMed PMID: 8602510.

[5] 萬海粟,周清華.慢(màn)病毒載體(tǐ)及其研究進展[J].中國(guó)肺癌雜志,2014,12(17):12.DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.12.09.

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