幹貨 | qPCR 實驗中關于 CT 值問(wèn)題的詳細攻略（上）

qPCR 實驗在分(fēn)析 C_T 時常常遇到這幾類問(wèn)題，比如(rú)：

• 複孔間重複性差，是否都(dōu)和操作(zuò)有關？

• 無模闆陰性對照(zhào)出現 C_T 值時，目的基因的 C_T 值是否還(hái)能用？

• C_T 值很大(dà)該怎麽辦？

今天就(jiù)給大(dà)家分(fēn)享下，在 qPCR 實驗中遇到關于 C_T 值的常見(jiàn)問(wèn)題時該如(rú)何解決。

複孔間重複性差一般會有以下兩種情況：

（1）C_T 值很大(dà)，如(rú) C_T ≥ 30，重複性差屬于正常現象。該現象符合泊松分(fēn)布，即在有效模闆量很少的情況下，模闆與引物的碰撞存在随機(jī)性，直接導緻複孔間的 C_T 值差異較大(dà)。

解決方法：如(rú)果融解曲線沒有雜峰，無模闆陰性對照(zhào)同目的基因的 △C_T 值爲 3 or 5 以上，那 C_T 值爲準确的，可(kě)多設置幾個複孔，選擇重複性好的 C_T 值參與計(jì)算。

（2）C_T ＜30，重複性較差。這種情況一般同操作(zuò)有關。

解決辦法：從(cóng)以下幾個方面進行問(wèn)題的排查：① 加樣準确度；② 移液器吸取液體(tǐ)的準确度；③ 定期校(xiào)準 qPCR 儀。

① 加樣準确度

• 避免小體(tǐ)積加樣，減少加樣誤差。可(kě)以将引物、SYBR Green Mix、ddH₂O 配置成混合體(tǐ)系，并且增加模闆的稀釋梯度，大(dà)體(tǐ)積加樣。如(rú)：原液 cDNA 添加 1 μL，可(kě)以更改爲原液 cDNA 稀釋 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH₂O 補齊體(tǐ)系至 20 μL 即可(kě)。

• SYBR Green Mix、配置的混合體(tǐ)系需要混合均勻。從(cóng) -20 ℃ 冰箱拿出的試劑需要完全融化并上下颠倒徹底混勻；配置體(tǐ)系時，将混在一起的 Mix 用移液器吹打混勻。

② 移液器吸取液體(tǐ)的準确度

• 移液器量程定期校(xiào)準，校(xiào)準周期爲 1 年(nián)。

• 購(gòu)買與移液器配套的槍頭，若槍頭與移液器不匹配，在吸取液體(tǐ)時易出現漏氣的現象，導緻吸取量程不準确。

• 在吸取相(xiàng)同量程的液體(tǐ)體(tǐ)積時，注意觀察每次吸取液體(tǐ)在槍頭内的液面高度是否一緻。

③ 定期校(xiào)準 qPCR 儀

• 一般 qPCR 儀校(xiào)準周期爲一年(nián)。

  
  

未完待續...

轉自(zì)：諾唯贊