幹貨 | qPCR 實驗中關于 CT 值問(wèn)題的詳細攻略（下）

造成 C_T 值偏大(dà)的因素較多，主要分(fēn)爲以下兩大(dà)類情況：

（1）相(xiàng)同體(tǐ)系，前期實驗 C_T 值正常，本次實驗，所有基因擴增 C_T 值皆偏大(dà)。

這種情況下，需要排查 RNA 是否存在降解。如(rú)何判定 RNA 是否存在降解呢(ne)？可(kě)通過 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

完整度好的 RNA 是有三條帶的，以真核生(shēng)物爲例，三條帶分(fēn)别是 28s、18s、5s，且 28s 條帶的亮度是 18s 的兩倍，5s 最暗（下圖左）。

如(rú)果 RNA 發生(shēng)降解，會出現三條帶的亮度發生(shēng)變化，甚至不存在完整的三條帶。如(rú)果 28s 幾乎看(kàn)不到了，整個泳道 Smear 嚴重，說(shuō)明 RNA 的降解已經很嚴重了，此時 RNA 不建議(yì)用作(zuò)後續的逆轉錄實驗（下圖右）。重新提取 RNA 重複實驗。

（2）該基因第一次擴增，其 C_T 值偏大(dà)，而其餘基因的 C_T 值正常。

這種情況下就(jiù)需要判定是因爲基因的擴增效率低導緻的 C_T 值偏大(dà)，還(hái)是基因本身(shēn)的表達量低造成的 C_T 值偏大(dà)。

如(rú)何判定是因爲基因的擴增效率低導緻的 C_T 值偏大(dà)，還(hái)是基因本身(shēn)的表達量低造成的 C_T 值偏大(dà)呢(ne)？首先需要計(jì)算引物的擴增效率。

可(kě)将基因的擴增産物進行梯度稀釋（至少三個梯度，且梯度之間的 △C_T 均一，防止因爲操作(zuò)原因導緻标準曲線線性關系差，進而影(yǐng)響擴增效率的計(jì)算），同時進行 qPCR。将得(de)到的标準曲線進行引物擴增效率的計(jì)算。

關于引物擴增效率的計(jì)算，可(kě)參考下面的案例：

① qPCR 擴增：

将 qPCR 産物進行原液、1/10、1/100 梯度稀釋，每個梯度設置三個複孔，進行 qPCR 擴增，複孔間 C_T 值取平均值，得(de)到三組 C_T 值。

② 标準曲線繪制及擴增效率計(jì)算：

可(kě)以在 excel 上進行擴增效率的計(jì)算。稀釋梯度可(kě)以設置爲 -1、-2、-3，每個梯度對應的 CT 值分(fēn)别爲 23.69、27.04、30.27，如(rú)下圖，進行标準曲線繪制。

通過标準曲線可(kě)以得(de)到線性方程（y = -3.29 x + 20.42）與 R² 值（R² = 0.9999）。将線性方程得(de)到的斜率（-3.29）帶入擴增效率計(jì)算公式中：，即可(kě)得(de)到擴增效率：101.35%。

隻有當擴增效率滿足 90~120%，且标準曲線 R² ≥ 0.99，引物的擴增效率才是合格的，定量出來(lái)的 C_T 值才可(kě)以用來(lái)計(jì)算。且擴增效率越接近 100%，引物的擴增性能越優。

1. 若擴增效率不滿足 90~120%，那 C_T 值偏大(dà)是因爲擴增效率不達标導緻的，需要重新設計(jì)引物。

2. 若引物的擴增效率滿足 90~120% 前提下，C_T 值仍然很大(dà)，則是基因本身(shēn)表達量低造成的 C_T 值偏大(dà)，可(kě)以提高模闆的添加量，但(dàn)最根本的方法是改爲探針法進行定量。探針法的靈敏度是高于染料法的。

轉自(zì)：諾唯贊