CAR-T生(shēng)産工(gōng)藝流程及優化考量（上）

發布時間：2020-08-11 13:13 信息來(lái)源：閱讀(dú)次數：次

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但(dàn)是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有着重要作(zuò)用。CD4+和CD8+CART應該有一個合适的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得(de)産生(shēng)更好的腫瘤消退療效。

調節性T細胞浸潤到實體(tǐ)腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信号通路(lù)活性。去(qù)除CD28CAR胞内段的Lck結合結構域，即使在調節性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分(fēn)化的初始樣T細胞（naïve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和幹細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自(zì)我更新能力，以及分(fēn)化爲效應和記憶T細胞的能力，因而有産生(shēng)更好臨床結果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而分(fēn)化的效應樣T細胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)雖然體(tǐ)外表現初強的抗腫瘤活性，但(dàn)是在體(tǐ)内，活化和增殖等能力均受損。

腫瘤高表達免疫檢查點配體(tǐ)，免疫細胞高表達免疫檢查點受體(tǐ)，則病人(rén)對于CART缺乏應答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分(fēn)子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如(rú)上文，TN和TSCM表達歸巢受體(tǐ)，而Teff不表達歸巢受體(tǐ)。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。

1. 細胞分(fēn)離(lí)和富集

分(fēn)離(lí)方法：傳統方法Ficoll密度梯度離(lí)心用于去(qù)除顆粒細胞、紅(hóng)細胞和血小闆；自(zì)動化的分(fēn)離(lí)系統：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。

基于CD3+進行細胞分(fēn)選，然後以磁珠爲基礎的技術(shù)如(rú)CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分(fēn)選或者去(qù)除特定的細胞群，以獲得(de)合理(lǐ)比例的CD4：CD8。

特定未分(fēn)化的TN，TSCM，TCM細胞對于臨床是有益的，但(dàn)是分(fēn)選流程複雜，在實際生(shēng)産流程中有一定困難。

2. T細胞激活

2.1anti-CD3/anti-CD28抗體(tǐ)活化

使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體(tǐ)）/抗CD28抗體(tǐ)包被磁珠作(zuò)爲人(rén)工(gōng)抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信号，anti-CD28提供共刺激信号。活化之後，磁珠可(kě)被磁鐵去(qù)除掉。

和可(kě)溶性OKT-3抗體(tǐ)相(xiàng)比，抗體(tǐ)包被磁珠活化細胞，具有更少的分(fēn)化，更少衰老的特點。另外富集和清洗細胞會更加簡單，昂貴抗體(tǐ)的丢失更少。因而磁珠法是生(shēng)産工(gōng)藝中最常用的方法，如(rú)諾華的Kymriah。

最近一種特殊的聚合物納米基體(tǐ)産品(T Cell TransAct)，上面結合有人(rén)源化CD3和CD28抗體(tǐ)，結合使用無血清培養基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但(dàn)是不改變PD-1的表達和基因轉染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin

Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可(kě)以增加逆轉錄病毒的感染效率。Retronectin和闆結合CD3抗體(tǐ)，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但(dàn)是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分(fēn)泌少等是缺點。

2.3 人(rén)工(gōng)APC細胞

人(rén)工(gōng)APC遞呈TAA給CART，使其活化。比如(rú)使用K-562同時表達TAA和共刺激分(fēn)子，不表達HLA-A，HLA-B，僅可(kě)用于TAA特異性CART活化。

3. 基因轉導系統

3.1病毒轉導

病毒轉染系統轉染效率高，最常用的是逆轉錄病毒載體(tǐ)和慢(màn)病毒載體(tǐ)。逆轉錄病毒将病毒DNA整合到宿主DNA中，産生(shēng)穩定的轉染。慢(màn)病毒需要調節基因來(lái)中和宿主細胞的防禦，削弱免疫反應，以及調節病毒複制。慢(màn)病毒載體(tǐ)，插入誘變和緻癌的風(fēng)險很低。

逆轉錄病毒生(shēng)産需要大(dà)量的包裝細胞，而慢(màn)病毒載體(tǐ)生(shēng)産需要大(dà)量質粒DAN進行瞬時轉染。病毒的生(shēng)産需要GMP級别的生(shēng)産車間和一系列的檢測方法，是病毒轉染細胞最大(dà)瓶頸。

諾華的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和施貴寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢(màn)病毒載體(tǐ)。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆轉錄病毒。

3.2 基于質粒的基因傳遞

轉座子/轉座酶系統是一種替代的非病毒基因傳遞策略。采用“睡美人(rén)”轉座子/轉座酶系統進行CART制造。該系統由兩個DNA質粒組成，一個編碼CAR，第二表達轉座酶，這是切除和插入轉基因所必需的。這種方法不需要GMP車間生(shēng)産病毒，成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用，産品已經開始在臨床實驗中使用。

3.3 基因編輯

CRISPR/Cas9能夠特異性地破壞多個基因的基因組基因座。CRISPR/Cas9系統結合腺相(xiàng)關病毒(AAV)載體(tǐ)，将CAR的DNA整合入T細胞受體(tǐ)a，提高T細胞效力，抑制T細胞分(fēn)化和衰竭。使用基因編輯和慢(màn)病毒轉導，用于産生(shēng)PD-1缺陷的CD19特異性CART，增強抗腫瘤活性。

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